【文獻(xiàn)分享】一種NT-proBNP替代抗原的成本效益優(yōu)化策略

Ruan Y等人提出了一種構(gòu)建NT-proBNP替代抗原的策略。以第10人纖維連接蛋白III型（FN3）為蛋白支架，將編碼NT-proBNP兩個(gè)抗原表位的堿基序列通過(guò)4GS或polyN連接體融合到FN3的FG環(huán)區(qū)和C端，再用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)融合蛋白（分別命名為FN3-epitopes-4GS和FN3-epitopes-polyN）進(jìn)行低成本的表達(dá)和純化。Western blot分析、ELISA、血清穩(wěn)定性測(cè)試和差示掃描量熱分析等一系列檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)N3可用于構(gòu)建雙抗原表位、且具有良好免疫反應(yīng)性的穩(wěn)定NT-proBNP替代抗原。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可高效生產(chǎn)FN3 NT-proBNP替代抗原且成本低，該策略在生物大分子替代抗原的生產(chǎn)方面具有潛在的應(yīng)用前景。

1.為什么要做NT-proBNP替代抗原

N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）在人血清中的濃度很低，且經(jīng)常被其他高濃度的蛋白污染，細(xì)胞培養(yǎng)成本高且容易降解，因此想要純化天然NT-proBNP制備標(biāo)準(zhǔn)抗原并不容易。

2.為什么選擇FN3做支架蛋白制備替代抗原

第10人纖維連接蛋白III型（FN3）是開(kāi)發(fā)非抗體結(jié)合域特別成熟的支架，被廣泛應(yīng)用于工程化新型結(jié)合蛋白；一些基于FN3的生物分子已被開(kāi)發(fā)用于臨床治療和診斷。FN3具備以下特點(diǎn)：

1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單
2）N端或C端非常靈活，可以在不破壞附近結(jié)構(gòu)二級(jí)構(gòu)象的情況下延伸，被認(rèn)為是一個(gè)合理、規(guī)則的抗原表位區(qū)域。
3）不含二硫鍵或游離巰基，有助于其在高溫（Tm =87°C）和還原環(huán)境的穩(wěn)定性。
4）三個(gè)靈活的表面環(huán)結(jié)構(gòu)（BC、DE和FG）與抗體可變區(qū)相似，BC和FG環(huán)中氨基酸序列的變化不會(huì)影響FN3大分子衍生物的穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列可以耐受高度人工引入的序列多樣性，且不會(huì)改變衍生物的穩(wěn)定性或溶解度。
5）FN3缺乏半胱氨酸殘基，可在大腸桿菌等細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)。
FN3獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征、優(yōu)越的生物物理特性及其與許多分子的相容性為制備檢測(cè)試劑盒中穩(wěn)定替代抗原提供了有利條件。

3.設(shè)計(jì)思路

抗體與靶標(biāo)的結(jié)合大多是高度特異性的。因此，一種抗體只能識(shí)別抗原的特定部分——“抗原表位”?？乖砦坏恼故臼求w外生產(chǎn)替代抗原的關(guān)鍵步驟。研究表明，線性表位與不連續(xù)構(gòu)象表位不同，是由氨基酸序列而不是三維形態(tài)決定的。因此，將特定的線性抗原表位偶聯(lián)到大分子載體上替代全長(zhǎng)抗原作為免疫原是一種可行的方法。目前NT-proBNP免疫的確切線性表位得到了很好的研究，可以通過(guò)穩(wěn)定的支架蛋白（如FN3）融合表達(dá)NT-proBNP的短線性表位肽，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以低成本促進(jìn)生產(chǎn)、純化和檢測(cè)。

3.1NT-proBNP表位的選擇

無(wú)論是在人類血液中還是在真核細(xì)胞中重組表達(dá)的NT-proBNP分子，中心部分都存在o糖基化修飾。因此，建議使用NT-proBNP的N端或C端特異性抗體對(duì)血清NT-proBNP進(jìn)行精確定量測(cè)量。此外，有報(bào)道稱NT-proBNP分子中心部分（28-45和46-60肽）的特異性抗體在免疫測(cè)定中很少與人血液樣本中的抗原結(jié)合。本研究選取NT-proBNP兩端的表位（線性表位12-21和62-73）工程化FN3。

3.2 NT-proBNP表位插入位點(diǎn)的選擇

選擇FN3晶體結(jié)構(gòu)中相距較遠(yuǎn)的C端和FG環(huán)，以減少相鄰兩個(gè)抗原表位之間局部構(gòu)象的影響，還可通過(guò)靈活的連接體[如polyN（SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）]將表位分開(kāi)。

4.核心試驗(yàn)概述

4.1質(zhì)粒構(gòu)建

首先合成編碼支架蛋白FN3的基因（其FG環(huán)和C端被NT-proBNP的兩個(gè)表位取代）。通過(guò)NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)克隆到pET28a(+)載體上。此外，編碼4GS連接子或polyN連接子的基因被引入表位62-73上游，產(chǎn)生兩個(gè)相似但不同的質(zhì)粒[命名為pET28a (+)-FN3-epitopes-4GS和pET28a (+)-FN3-epitopes-polyN]。DNA測(cè)序結(jié)果顯示表位DNA和連接子成功插入質(zhì)粒。

4.2同源性建模

為了獲得末端線性表位的三維結(jié)構(gòu)，利用RaptorX （http://www.raptorx.uchicago.edu/）進(jìn)行同源性建模。首先從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB:1FNA）中檢索FN3的氨基酸序列，以作為同源性建模的靶點(diǎn)。利用RaptorX進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和基于模板的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。最后在PyMOL中對(duì)兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)（The PyMOL Molecular Graphics System，版本1.5.0.3)。

4.3蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化

為制備顯示NT-proBNP兩個(gè)表位的重組FN3蛋白（簡(jiǎn)稱FN3-epitopes），將質(zhì)粒pET28a(+)-FN3-epitopes-4GS或pET28a(+)-FN3-epitopes-polyN轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）。挑取單個(gè)菌落，將培養(yǎng)物以1/100的比例接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入0.2mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在 25℃搖床上繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)FN3-epitopes表達(dá)，6小時(shí)后離心收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)超聲破碎，12000g離心后即可獲得粗產(chǎn)物。將含有目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解上清液在40°C下加熱10min。然后高速去除沉淀，獲得上清液，加入到HisTrap™HP中進(jìn)行純化。通過(guò)SDS-PAGE或Western blot分析檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化情況，用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

4.4驗(yàn)證

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了熱變性實(shí)驗(yàn)、Western Blot分析、可溶性蛋白檢測(cè)、抗原結(jié)合能力的評(píng)價(jià)、差示掃描量熱法（DSC）及FN3-Epitopes-polyN血清穩(wěn)定性試驗(yàn)（詳細(xì)信息見(jiàn)原文）。

5.結(jié)果

5.1FN3-Epitopes的結(jié)構(gòu)

選擇NT-proBNP表位序列12-21和62-73，在FN3空間結(jié)構(gòu)上距離相對(duì)較遠(yuǎn)的兩個(gè)位置（FG環(huán)和C端）分別植入，以避免兩個(gè)表位之間可能發(fā)生的相互作用。FN3 FG環(huán)區(qū)氨基酸序列RGDSPASSK被NT-proBNP表位12-21取代，NT-proBNP的62-73表位與FN3的C端重組。此外，在FN3結(jié)構(gòu)域引入polyN （SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）連接子，將NT-proBNP兩個(gè)表位融合到FN3結(jié)構(gòu)域，以保證靶蛋白的正常功能，重組蛋白分別命名為FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS（圖1）。額外的連接子KKGKGKKGK，可以促進(jìn)重組蛋白（FN3-epitopes，即FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes- 4GS）與其他分子的偶聯(lián)，如生物素和過(guò)氧化物酶。

圖1. FN3、FN3-Epitopes的部分序列和結(jié)構(gòu)

注：（A）NT-proBNP表位修飾的FN3蛋白部分序列。綠色字母代表FN3的FG環(huán)（RGDSPASSK）區(qū)域或C端（EI），紅色字母代表FG環(huán)插入的NT-proBNP表位12-21 （LETSGLQEQR）或C端插入的表位62-73 （RGHRKMVLYTLR）。灰色字母表示插入的4GS連接子或polyN連接子。（B）FN3的三維結(jié)構(gòu)（青色）和NT-proBNP表位序列重組的FN3建模結(jié)構(gòu)（表位12-21和62-73用紅色線表示），4GS連接子或polyN連接子用深灰色線表示。FN3的骨架是青色的，它與黃色的同源模型重疊。

5.2FN3-Epitopes的表達(dá)

重組FN3-epitopes可被針對(duì)NT-proBNP不同氨基酸殘基（13-27和61-76）的商業(yè)單克隆抗體識(shí)別。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）和FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）在IPTG誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)（圖2A，圖2B）。Western blot分析表明，重組蛋白FN3-epitopes能夠與所選抗體特異性結(jié)合（圖2C，圖2D）。

圖2. 重組FN3-Epitopes在大腸桿菌中的表達(dá)

注：（A, B）誘導(dǎo)1-6小時(shí)后，通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白FN3-epitopes-4GS （A）和FN3-epitopes-polyN （B）的表達(dá)情況，箭頭所指為靶蛋白。（A, B）的右側(cè)為SDS-PAGE圖像的信號(hào)強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。（C, D）Western blot分析FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）在指定誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，（C）和（D）分別使用HRP標(biāo)記的NT-proBNP（表位13-20）和NT-proBNP（表位63-71）抗體。（A, B,C, D）中的M為Marker。

5.3FN3-Epitopes的純化

FN3-epitope在大腸桿菌中主要以可溶性形式表達(dá)（圖3A，圖3B）。在相似蛋白表達(dá)水平下，蛋白FN3-epitopes-4GS的純化效率明顯低于蛋白FN3-epitopes-polyN（圖3C，圖3D）。此外，為便于親和層析純化，研究人員進(jìn)行了熱變性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同溫度條件下（37-70℃）FN3-epitopes-polyN蛋白的降解水平。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，F(xiàn)N3-epitopes-polyN蛋白逐漸從上清轉(zhuǎn)移到沉淀。在40℃下，大約30%的異源蛋白析出，而60%的目標(biāo)蛋白仍存在于上清中（圖3E，圖3F；詳細(xì)信息見(jiàn)補(bǔ)充圖1）。利用這種熱穩(wěn)定性，研究人員優(yōu)化了純化工藝，將FN3-epitopes-polyN細(xì)胞裂解液的上清加熱到40°C，然后在進(jìn)行金屬螯合層析，從而獲得更高質(zhì)量的純化蛋白（~ 40mg/L）。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白FN3-epitopes-polyN的純度約為100%（圖3D）；這些蛋白無(wú)需進(jìn)一步純化，可作為校準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品。

圖3. 重組FN3-epitopes的溶解性和純化

注：（A,B）分別為大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)的可溶性FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果。箭頭所指為靶蛋白FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）或FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）。Lane 1為總蛋白裂解物的沉淀；Lane 2為總蛋白裂解液上清。（C, D）為通過(guò)HisTrap™分離純化FN3-epitopes-4GS（C）和FN3-epitopes-polyN（D）的SDS-PAGE結(jié)果。（C）中Lane 1-3的蛋白用60mM咪唑依次洗脫；（D）中Lane 1-3的蛋白用80mM咪唑依次洗脫。（E, F）為FN3-epitopes-polyN（E）和除FN3-epitopes-polyN外的其他蛋白（F）的熱降解直方圖，數(shù)據(jù)為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。（A, B,C, D）中的M為Marker。

補(bǔ)充圖1. SDS-PAGE分析不同溫度條件下的熱降解檢測(cè)

注：目標(biāo)蛋白用黑框圈出。上圖為上清液中總蛋白。下圖為沉淀物中的總蛋白質(zhì)。M為Marker。

5.4FN3-Epitopes的抗原反應(yīng)性

以野生型FN3為陰性對(duì)照，采用雙抗體夾心ELISA法系統(tǒng)評(píng)價(jià)重組FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS的免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示兩種重組FN3-epitopes與特異性抗體均具有良好的線性關(guān)系，其中FN3-epitopes-polyN在0.06~12.85ng/ml范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2大于0.99（圖4B, 補(bǔ)充圖2）。與FN3-epitopes-4GS相比，F(xiàn)N3-epitopes-polyN在低濃度下表現(xiàn)出更好的親和力。綜上所述，NT-proBNP的雙表位可以在FN3結(jié)構(gòu)域上成功展示，并保持其原有的高抗原反應(yīng)性。本研究重點(diǎn)分析了易于純化和親和力較好的重組蛋白FN3-epitopes-polyN。

圖4. 重組蛋白FN3-epitopes-polyN的免疫反應(yīng)性和穩(wěn)定性檢測(cè)

注：（A）夾心ELISA方案。（B）夾心ELISA法檢測(cè)免疫反應(yīng)性。捕獲和檢測(cè)抗體分別為NT-proBNP（表位63-71）和酶標(biāo)NT-proBNP（表位13-20）抗體，底物溶液為TMB。（C）Western blot分析血清FN3蛋白（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的穩(wěn)定性。（D）DSC熱穩(wěn)定性檢測(cè)顯示，F(xiàn)N3-epitopes-polyN（Tm= 83.9°C）和野生型FN3（Tm= 84.9°C）具有相似的高Tm值。

補(bǔ)充圖2. 夾心ELISA檢測(cè)抗原反應(yīng)性

注：捕獲抗體為NT-proBNP（63-71）抗體（3.5μg/mL），檢測(cè)抗體為酶標(biāo)NT-proBNP（13-20）抗體（0.35μg/mL），底物溶液為TMB，檢出限為0.06ng/mL。

5.5FN3-Epitopes-polyN的體外穩(wěn)定性

為了明確兩個(gè)額外表位的融合是否對(duì)重組蛋白的穩(wěn)定性有影響，研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了FN3-epitopes-polyN的血清穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。體外重組蛋白FN3-epitopes-polyN的血清穩(wěn)定性檢測(cè)是在正常人血漿中進(jìn)行的。結(jié)果表明，與非工程化FN3相似，在正常人血漿中37℃孵育80 h后，F(xiàn)N3-epitopes-polyN降解（圖4C）。DSC結(jié)果顯示，F(xiàn)N3-epitopes-polyN蛋白檢測(cè)只有一個(gè)單峰（Tm=83.9°C），且與野生型FN3的Tm值相近（Tm=84.9°C），說(shuō)明純化后的FN3-epitopes-polyN蛋白保持了非工程化FN3的穩(wěn)定性（圖4D）。上述穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，重組蛋白FN3-epitopes-polyN將是NT-proBNP抗原的高度穩(wěn)定替代品。

6.總結(jié)

基于支架蛋白構(gòu)建替代抗原是一種很有前景的成本效益優(yōu)化策略。本研究以N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）的兩個(gè)肽表位為例，提出了構(gòu)建第10人纖維連接蛋白III型（FN3）替代抗原的策略。結(jié)果顯示，基于FN3支架構(gòu)建的NT-proBNP替代抗原具有與NT-proBNP相同的免疫反應(yīng)性、良好的生物物理特性和穩(wěn)定性；可以在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中快速高效地產(chǎn)生，相較于真核細(xì)胞表達(dá)或化學(xué)合成操作更簡(jiǎn)單、成本更低。

參考文獻(xiàn)

Ruan Y, Chao S, Hu X, et al. FN3 Domain Displaying Double Epitopes: A Cost-Effective Strategy for Producing Substitute Antigens[J]. Front Mol Biosci, 2021,8:742617.?

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