目前BNP及NT-proBNP檢測存在的問題及解決方案

B型利鈉肽（BNP）及N末端B型利鈉肽前體（NT-proBNP）是心臟功能生物標(biāo)志物，同時(shí)也是心力衰竭診斷與鑒別診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評估的首選生物標(biāo)志物。隨著臨床研究的不斷深入，BNP/NT-proBNP的實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床應(yīng)用暴露出諸多問題。外部質(zhì)量評估研究的數(shù)據(jù)表明，免疫分析法測量的BNP值之間存在著很大的系統(tǒng)性差異（最多2倍），即使是使用同一制造商的校準(zhǔn)品和材料，NT-proBNP仍顯示出低于20%的方法間差異[2][4]。

實(shí)際上BNP/NT-proBNP檢測，測得的是多種混合肽段。無論是BNP/NT-proBNP檢測系統(tǒng)間還是方法間的差異，在一定程度上可歸因于外周血中有BNP、NT-proBNP和proBNP三種相關(guān)肽段，及其進(jìn)一步降解或修飾的異質(zhì)性肽段。

1.proBNP及聚體的影響

眾所周知，BNP來源于pre-proBNP，它在N端包含一個(gè)信號肽序列。在信號肽被切割后，proBNP進(jìn)一步被蛋白水解分裂成無活性的N端片段和具有生物活性的肽激素BNP。裂解大部分發(fā)生在心肌細(xì)胞內(nèi)部或表面，未分泌到血液中，但在循環(huán)中也發(fā)現(xiàn)少量完整的proBNP。研究證實(shí)心房提取物和心力衰竭患者的血漿中同時(shí)存在BNP、proBNP和NT-proBNP。

proBNP會(huì)形成聚體，proBNP的N端區(qū)域含有亮氨酸拉鏈狀基序，在生理?xiàng)l件下可能誘導(dǎo)血漿中的肽低聚，產(chǎn)生proBNP的三聚體或四聚體以及NT-proBNP的三聚體。這些寡聚分子可能會(huì)掩蓋BNP/NT-proBNP商業(yè)檢測中使用的抗體識別表位，影響B(tài)NP和NT-proBNP的分析特異性[3]。

BNP檢測試劑與proBNP間的交叉反應(yīng)約為0.1%-40.0%。此外，由于BNP檢測試劑使用的抗體種類較多，且不同抗體識別表位不同，導(dǎo)致BNP檢測平臺間差異達(dá)15%-50%。NT-proBNP檢測與proBNP存在交叉，但不與BNP交叉。絕大多數(shù)NT-proBNP商業(yè)化檢測方法采用相同的抗體和校準(zhǔn)品，但不同平臺間仍有8%-23%的差異[4]。

圖1. B型利鈉肽的生化表達(dá)[1]

2.BNP/NT-proBNP的異質(zhì)性

2.1BNP的裂解

血漿和組織中有幾種蛋白水解酶可以降解利鈉肽，包括腦啡肽酶、二肽基肽酶IV、胰島素降解酶和肽基精氨酸醛蛋白酶[2]。在體內(nèi)，受損血管的腔內(nèi)表面，帶負(fù)電荷的表面激活凝固接觸活化系統(tǒng)后，鉀激肽激酶可能會(huì)對BNP的C端結(jié)構(gòu)進(jìn)行水解。在血液循環(huán)中（或采血后），BNP N端的絲氨酸和脯氨酸殘基上可能會(huì)迅速發(fā)生蛋白水解，這使得BNP的降解更加敏感[3]。

2.2NT-proBNP的裂解

大多數(shù)免疫反應(yīng)性的NT-proBNP明顯小于NT-proBNP 1-76。迄今為止，尚未用高效液相色譜法在心力衰竭患者血漿中檢測到完整的NT-proBNP（1-76氨基酸）。HPLC分析表明，循環(huán)免疫反應(yīng)性的NT-proBNP具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，且兩端都可能發(fā)生裂解，并且這種裂解在血清中比在血漿中更加明顯[3]。有證據(jù)顯示，NT-proBNP的N端易受到血液中發(fā)生的修飾并改變其免疫反應(yīng)性，C端易被蛋白水解。但某些特定的肽表位仍顯示出較高的穩(wěn)定性，可用于免疫檢測[1]。

2.3NT-proBNP的糖基化修飾

大多數(shù)用于NT-proBNP免疫測定的抗體都是針對其末端的。NT-proBNP中部表位不適于檢測，因?yàn)橹胁课稽c(diǎn)易被糖基化修飾或形成低聚物，阻礙抗體與表位的結(jié)合，導(dǎo)致NT-proBNP檢測結(jié)果偏低。有研究建議NT-proBNP檢測的最佳候選表位為N端13-24和C端63-76[1][4]。

3.BNP/NT-proBNP檢測的特異性

3.1BNP的檢測特異性

目前BNP分析都受到proBNP循環(huán)濃度和截?cái)郆NP代謝物的影響，導(dǎo)致生物活性BNP 1-32濃度估計(jì)過高[2][5]。商業(yè)BNP檢測試劑是基于兩種單克隆抗體或單克隆抗體和多克隆抗體組合的三明治型免疫測定。通常一種抗體與二硫鍵形成的環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，另一種抗體與BNP的C端或N端結(jié)合。二硫鍵介導(dǎo)的環(huán)結(jié)構(gòu)和C端結(jié)構(gòu)在血液樣本中似乎是穩(wěn)定的，但目前也沒有數(shù)據(jù)表明BNP抗體不識別proBNP。此外，BNP（1-32氨基酸）釋放進(jìn)入循環(huán)后，在NH2端降解為BNP 3-32，這種降解可能會(huì)影響結(jié)合肽N端表位的抗體親和力[3]。

3.2NT-proBNP的檢測特異性

通常NT-proBNP商業(yè)免疫檢測試劑使用非糖基化校準(zhǔn)材料，且大多數(shù)抗體是針對具有潛在O-糖基化位點(diǎn)占用的表位。而大部分與NT-proBNP和proBNP相關(guān)的循環(huán)無活性肽是O糖基化修飾的，因此這些商業(yè)化試劑不能測量NT-proBNP相關(guān)的糖基化肽。此外，NT-proBNP檢測結(jié)果還會(huì)受到完整proBNP（尤其是非糖基化）和其他短肽干擾[2]。

圖2. Uniprot數(shù)據(jù)庫給出的proBNP糖基化位點(diǎn)（P16860）

表2. BNP/NT-proBNP商用抗體的反應(yīng)性[3]

3.3校準(zhǔn)品與樣品的組分差異

理論上，對于BNP和NT-proBNP分析，都要求校準(zhǔn)品的組成與患者樣品中存在的分析物相似。然而，由于這些多肽是異質(zhì)的，它們在人體體液中的組成可能會(huì)有很大的變化。即使校準(zhǔn)品在某種程度上可能類似于人體體液中存在的分析物的典型異質(zhì)混合物，但它們可能只代表一種“平均”狀況[3]。

4.相關(guān)解決方案

4.1識別表位

在抗體生產(chǎn)和免疫分析設(shè)計(jì)選擇表位時(shí)，應(yīng)考慮到BNP/NT-proBNP的異質(zhì)性[3]。1）為降低不同BNP檢測平臺間的差異，避免降解短肽段的漏檢，BNP 6-26區(qū)段（包含環(huán)狀區(qū)在內(nèi)）為最佳的抗體識別表位[4]。2）為減少糖基化的影響，NT-proBNP檢測抗體的識別表位應(yīng)避開糖基化區(qū)域[4]。試劑廠家應(yīng)明確抗體識別的精確表位，以供參考[3]。

4.2樣本采集

當(dāng)測量BNP時(shí)，血液應(yīng)用含有EDTA的塑料管采集。EDTA螯合可以使中性內(nèi)肽酶（NEPs）失活。但BNP仍會(huì)繼續(xù)降解，添加蛋白酶抑制劑（如抑酶蛋白），可穩(wěn)定更長時(shí)間[3]。

4.3樣本保存

如在室溫下儲(chǔ)存，BNP樣品應(yīng)在收集后4小時(shí)內(nèi)盡快檢測。或離心分離血漿，加入鉀化鉀素或絲氨酸特異性蛋白酶抑制劑，在4℃下冷藏。如保存超過72小時(shí)，應(yīng)在-70℃下冷凍[3]。

NT-proBNP在血清、肝素化血漿和EDTA血漿中的濃度相對穩(wěn)定，可在室溫或4℃保存72小時(shí)，-80℃下保存一年[3]。

4.4試劑校準(zhǔn)

目前，尚無參考物質(zhì)可用，無法實(shí)現(xiàn)BNP/NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)化。試劑廠家應(yīng)提供校準(zhǔn)品的來源、種類等盡可能詳盡的信息；以及材料純度和濃度的分析文件，并提供校準(zhǔn)曲線的描述（例如：點(diǎn)數(shù)、曲線或直線響應(yīng)）等[3][4]。

4.5國際單位

由于缺乏對SI單位的可追溯性，建議使用ng/L代替pmol/L[3]。

4.6交叉反應(yīng)性

試劑廠家應(yīng)提供BNP和NT-proBNP檢測與BNP 3-32的交叉反應(yīng)性，以及所有NP和其他肽激素（包括proBNP及其多聚體）的交叉反應(yīng)性。BNP檢測應(yīng)證明與BNP 3-32具有100%的交叉反應(yīng)性[3]。

參考文獻(xiàn)

[1]Harpaz D, Seet RCS, Marks RS, et al. B-Type Natriuretic Peptide as a Significant Brain Biomarker for Stroke Triaging Using a Bedside Point-of-Care Monitoring Biosensor[J]. Biosensors (Basel). 2020,10(9):107.
[2]Clerico A, Zaninotto M, Passino C,et al. New issues on measurement of B-type natriuretic peptides[J]. Clin Chem Lab Med, 2017,56(1):32-39.
[3]Apple FS, Panteghini M, Ravkilde J, Mair J, Wu AH, Tate J, Pagani F, Christenson RH, Jaffe AS; Committee on Standardization of Markers of Cardiac Damage of the IFCC. Quality specifications for B-type natriuretic peptide assays. Clin Chem. 2005 Mar;51(3):486-93.
[4]中國醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)心血管專家委員會(huì).B型利鈉肽及N末端B型利鈉肽前體實(shí)驗(yàn)室檢測與臨床應(yīng)用中國專家共識[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2022,102(35):2738-2754.
[5] Lewis LK, Raudsepp SD, Yandle TG,et al. Development of a BNP1-32 Immunoassay That Does Not Cross-React with proBNP[J]. Clin Chem,2017,63(6):1110-1117.

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