從基因&蛋白組學(xué)水平分析猴痘ⅠB進(jìn)化支對MPXV檢測的影響

2022年，猴痘病毒（MPXV）Ⅱ進(jìn)化支在全球爆發(fā)，傳播到111個以上此前未報告病例的國家，主要影響歐洲和美洲的男同性戀群體。在接下來的一年里，非洲的MPOXⅠ進(jìn)化支病例數(shù)量激增，截至2024年6月，剛果民主共和國26個省中的25個省報告了2萬多例病例和1000例死亡。最近發(fā)現(xiàn)，部分原因是由于2023年9月始于南基伍省卡米圖加（Kamituga）市另一種猴痘暴發(fā)。由高度分化的MPXVⅠ進(jìn)化支引起，現(xiàn)在被指定為Ⅰb進(jìn)化支。

1.Ⅰb進(jìn)化支與其他進(jìn)化支有何不同

1.1 傳播方式

猴痘進(jìn)化分支直接決定了的傳播途徑及感染相關(guān)的癥狀。MPXVⅠ和Ⅱa進(jìn)化支很少在人與人之間傳播，主要由嚙齒動物和小型哺乳動物通過人畜共患傳播，而Ⅱb進(jìn)化支則通過與受感染個體的性接觸和非性接觸在人與人之間有效傳播。在提出的Kamituga Ⅰ進(jìn)化支暴發(fā)之前，很少有MPXVⅠ進(jìn)化支人際傳播病例的記錄；而在Kamituga市發(fā)現(xiàn)的Ⅰb進(jìn)化支主要通過與感染個體的異性性接觸傳播，且觀察到廣泛年齡范圍（包括兒童）的社區(qū)傳播。Ⅰb進(jìn)化支人與人之間的傳播方式，可能更容易造成社區(qū)層面的傳播。

1.2 基因序列

為了鑒定Kamituga暴發(fā)期間MPXV基因組的突變，以全基因組方式對參考基因組（NC_003310.1）進(jìn)行了定位。猴痘病毒Ⅰb進(jìn)化支RNA全基因組測序結(jié)果顯示，Kamituga序列與其他Ⅰ進(jìn)化支成員的分離可能是由于大量的移碼突變、插入和缺失。研究人員獲得的6個Ⅰb進(jìn)化支樣本平均存在201.5個SNP、28個插入、81個缺失（deletion）、2個缺失（indel）、311.5個總突變、158.3個氨基酸替換、81.66個基因間突變、72.16個同義突變、106個錯義突變、41.16個移碼突變和3.33個框內(nèi)缺失。通過在蛋白質(zhì)組水平上對Kamituga MPXV序列進(jìn)行突變定位，觀察到在這些突變中，包括C9L（OPG047）、I4L（OPG080）、L6R（OPG105）、A17L（OPG143）、A25R（OPG151）、A28L（OPG153）和B21R（OPG210）在內(nèi)的7個蛋白為突變熱點(diǎn)，出現(xiàn)了許多一致的框內(nèi)缺失、移碼突變、同義突變和氨基酸替換。在6個樣本中還發(fā)現(xiàn)了D14L（OPG032）基因共同缺失，以及在參考基因組中不存的14個獨(dú)特基因D2L、D4L、D17L、D18L、C3L、A26L、A27L、A48R、B15L、B1R、B18R、K1R、R1R和N2R[1]。

Kamituga MPXV ⅠB進(jìn)化支突變圖譜

圖1. Kamituga MPXV ⅠB進(jìn)化支突變圖譜

注：基于參考MPXVⅠ進(jìn)化支基因組（ID:NC_003310）的結(jié)構(gòu)示意圖基因名稱和位置，根據(jù)正痘病毒基因命名法（如OPG001）和更新的MPXV RefSeq（J1L）注釋繪制。基因的取向反映在箭頭上。紅色、藍(lán)色和粉紅色字分別表示錯義、同義和蛋白質(zhì)改變的突變名稱。紅色圓圈表示框內(nèi)缺失突變，藍(lán)色矩形表示移碼突變。每個頂部有一個圓圈的黑線表示EBI定義的新功能/稀有功能。基因根據(jù)其生物學(xué)功能用顏色區(qū)分。綠色：參與免疫調(diào)節(jié)，橙色：轉(zhuǎn)錄，紫色：病毒復(fù)制/修復(fù)，黃色：細(xì)胞進(jìn)入/附著，粉色：形態(tài)發(fā)生；深藍(lán)色：毒力；淺藍(lán)色：細(xì)胞間融合，黑色：假設(shè)的基因，淺黃色：未知的基因。被刪除的Ⅰ進(jìn)化支特異性O(shè)PG032基因用紅色箭頭表示。

1.3 突變熱點(diǎn)蛋白

1.3.1 C9L（OPG047）

猴痘中的C9L基因編碼一種Kelch樣蛋白，該蛋白作為先天免疫反應(yīng)的拮抗劑發(fā)揮重要作用。C9L是MPXV基因組中唯一的Kelch樣蛋白，而其他正痘病毒含有多種Kelch樣蛋白。C9L基因在正痘病毒中高度保守。在VACV中，C9L在感染早期表達(dá)，并作為Ⅰ型干擾素反應(yīng)拮抗劑，編碼一種錨蛋白重復(fù)蛋白/F-box蛋白，該蛋白在感染VACV的人細(xì)胞中顯示干擾抗病毒活性。MPXV C9L基因含有RNA Gquadraplex（RG4），該基因在基因組進(jìn)化后易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化（不穩(wěn)定性）。在MPXV中，就像VACV一樣，C9L蛋白被認(rèn)為可以抑制宿主的先天免疫反應(yīng)，但還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。有人提出，在2022年全球爆發(fā)期間測序的猴痘基因組包含最不穩(wěn)定的RG4結(jié)構(gòu)（即C9L-RG4-5），C9L的變異性可能驅(qū)動病毒的傳播。在MPXVⅠB進(jìn)化支中C9L具有一個框內(nèi)缺失（DGMG483-486E）和一個移碼突變（D483X），具有三個一致的氨基酸替換（L151H，V127E和Y114N）。與V亞群（JX878417）相比，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有獨(dú)特的框內(nèi)缺失。

1.3.2 I4L（OPG080）

I4L是一個編碼核糖核苷酸還原酶（RR）大亞基蛋白的基因，該蛋白可能參與核苷酸的合成。該基因在非分裂細(xì)胞中的病毒復(fù)制中起作用。RR是高度保守的酶，在三磷酸脫氧核苷（dNTP）合成過程中催化限速步驟；在正痘病毒（包括VACV和MPXV）中，RR編碼R1和R2亞基，可作為抗病毒靶點(diǎn)。在MPXVⅠB進(jìn)化支中I4L有兩個一致的同義突變（T372和T31），三個氨基酸替換（A685P，R358G和G260S）。

1.3.3 L6R（OPG105）

L6R（OPG105）基因編碼RNA聚合酶亞基（RPO147），在猴痘中的作用很少被描述；該基因可能在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄中起作用。分析顯示在MPXVⅠB進(jìn)化支中，該蛋白含有一個共性移碼突變（P285X），一個同義突變（A396）和三個氨基酸替換（V431A，R475C和D506Y）。

1.3.4 A25R（OPG151）

A25R基因編碼RPO132亞基，預(yù)計該亞基是病毒RNA聚合酶復(fù)合物的一個組成部分，對病毒將其DNA復(fù)制成RNA的能力至關(guān)重要。盡管A25R對MPXV致病性的具體貢獻(xiàn)尚未完全了解，但其在各種MPXV中的高度保守性強(qiáng)調(diào)了其在病毒生命周期中的關(guān)鍵作用。A25R基因位于病毒基因組的核心區(qū)中心，與其他正痘病毒的序列同源性超過90%，這進(jìn)一步凸顯了其作為藥物靶點(diǎn)的重要性和潛力。需要進(jìn)一步的研究來闡明A25R對毒力和宿主相互作用的確切貢獻(xiàn)。

1.3.5 A17L（OPG143）

A17L是宿主細(xì)胞進(jìn)入和融合所必需的病毒包膜蛋白。在VACV中，A17L在病毒粒子組裝中起著重要作用，并有助于確定蛋白質(zhì)相互作用、裂解、磷酸化和二硫鍵形成的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。A17L被F10激酶磷酸化，是感染后期表達(dá)的VACV的主要跨膜組分。盡管該基因尚未在MPXV中明確描述，考慮到它在研究樣本中高度保守，它可能增強(qiáng)了病毒的進(jìn)入和感染。在MPXVⅠB進(jìn)化支中，該蛋白包含兩個一致的同義突變（E110和R127）和三個氨基酸替換（A289T，V304A，V322A）。

1.3.6 C7L（OPG045）

C7L基因在MPXV中的作用類似于F1L基因在VACV中的作用。在VACV中，F(xiàn)1L作為細(xì)胞凋亡抑制劑，通過與促凋亡的Bcl-2家族蛋白Bak和Bax結(jié)合，幫助病毒逃避宿主的先天免疫防御。這些蛋白是線粒體膜完整性和細(xì)胞色素C釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。F1L還能抑制caspase-9和NLRP1炎性體，從而增強(qiáng)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和存活。雖然直接研究C7L在MPXV中作用的具體研究并不普遍，但考慮到正痘病毒家族成員之間的遺傳和功能相似性，推斷C7L可能在MPXV中發(fā)揮類似的作用。該基因可能會抑制免疫反應(yīng)，增強(qiáng)病毒在宿主內(nèi)的存活和傳播。

1.3.7 A28L（OPG153）

A28L編碼P4c前體蛋白，參與宿主的細(xì)胞進(jìn)入和退出過程。該基因顯示出很高的保留率，這表明它在病毒的生命周期中起著至關(guān)重要的作用，并有可能成為疫苗開發(fā)的目標(biāo)。在最近的一項研究中，從A28L蛋白中鑒定了大量的表位，并提出了多表位候選疫苗，表明其免疫原性潛力。對這些表位的分析表明，它們可以引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是一種潛在的MPXV免疫原性結(jié)構(gòu)設(shè)計補(bǔ)充方案。在ⅠB進(jìn)化支的A28L中觀察到7個殘基移碼缺失（DDDDDII367-373-）、移碼突變（D384X、D386X和DD386-387X）和兩個氨基酸取代。

1.4 早前的研究熱點(diǎn)蛋白

A29L、A35R、B6R、M1R等是早前猴痘研究中比較熱點(diǎn)的位置。在MPXVⅠB進(jìn)化支中，A29L（OPG154）、A35R（OPG161）這兩個蛋白的基因未發(fā)生突變，而B6R（OPG190）和M1R（OPG095）上發(fā)生了同義突變。

2.高度分化對分子檢測的影響

MPXVⅠ進(jìn)化支和Ⅱ進(jìn)化支之間的序列相似度> 99%，與其他正痘病毒相似度> 90%，這為進(jìn)化支特異性靶序列的開發(fā)帶來了極大的挑戰(zhàn)。美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）針對不同的進(jìn)化支推薦了相應(yīng)的引物：MPXV通用（G2R_G）、Ⅰ進(jìn)化支（C3L）和Ⅱ進(jìn)化支（G2R_WA）。新報道的MPXVⅠb進(jìn)化支的基因組分析顯示，Ⅰ進(jìn)化支MPXV的靶序列（在C3L基因內(nèi)）缺失，這種缺失將影響MPXV進(jìn)化支檢測的準(zhǔn)確性（取決于所使用的檢測方法），導(dǎo)致新型Ⅰb進(jìn)化支菌株的假陰性結(jié)果，這可能影響對Ⅰb進(jìn)化支病毒的傳播監(jiān)測和防控，特別是在目前流行的MPXVⅡb進(jìn)化支（溫和病毒）存在的情況下[2]。

Ⅰb進(jìn)化支的PCR檢測方法

鑒于MPXVⅠb進(jìn)化支靶序列（在C3L基因內(nèi)）缺失，最近有研究人員開發(fā)了一種新的實(shí)時PCR檢測（dD14-16）專門用于檢測MPXVⅠb進(jìn)化支，并且可以與其他基于Taqman的檢測方法一起用于MPXV檢測區(qū)分。但由于實(shí)驗的MPXV DNA剩余不足，未進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗，該方法有效性還有待進(jìn)一步證實(shí)。

MPXV特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

圖2. MPXV特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

注：dD14-16檢測采用具有一個5'-報告分子（FAM）和一個3'-猝滅分子（BHQ1）的探針，即5'-FAM-ATATTCAGGCGCATATCCACCCACGT-BHQ-3'，正向引物5'-AAGACTTCCAAACTTAATCACTCCT-3'，反向引物5'-CGTTTGATATAGGATGTGGACAT TT-3'。MPXV_CladeIb_1L/2L/3L/4L/7O/9L是Masirika等人首次描述的Ⅰb進(jìn)化支序列。圖A中MPXV通用引物和探針在Ⅱa進(jìn)化支和Ⅱb進(jìn)化支中存在正向和反向引物不匹配（彩色）。圖B中Ⅰ進(jìn)化支的CDC引物和探針在Ⅰb進(jìn)化支中缺失，僅在Ⅰ進(jìn)化支中存在。圖C中新的正向和反向引物和探針，跨越Ⅰb進(jìn)化支序列缺失的上下區(qū)域。與先前描述的Ⅰ分支序列（如序號7（MPXV_Clade1_DQ011155））相比，缺失1140 bp。

參考文獻(xiàn)

[1]Masirika LM, Kumar A, Dutt M, et al. Complete Genome Sequencing, Annotation, and Mutational Profiling of the Novel Clade I Human Mpox Virus, Kamituga Strain. J Infect Dev Ctries[J]. 2024,18(4):600-608.
[2]Schuele L, Masirika LM, Udahemuka JC,et al. Real-time PCR assay to detect the novel Clade Ib monkeypox virus, September 2023 to May 2024. Euro Surveill[J].2024,29(32):2400486.