膠體金實驗影響因素
對于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的抗原、抗體診斷原料，大多都可以滿足膠體金檢測平臺的要求，但是由于體外診斷（IVD）試劑原料產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，很多IVD原料供應(yīng)商不會對自己的抗原/抗體診斷原料是否可以應(yīng)用于膠體金平臺而進行驗證。相對來說，膠體金方法對抗原、抗體診斷原料的要求是比較高的，因為不管是膠體金標(biāo)記還是NC膜包被都是基于物理吸附作用，這種結(jié)合過程是相對脆弱的，很容易受到干擾。本文主要對與抗原/抗體有關(guān)的膠體金實驗影響因素做一介紹。
1. 蛋白純化方法
鎳柱純化：重組抗原/抗體通常帶有his等標(biāo)簽，通過鎳柱純化得到的抗原/抗體診斷原料含有大量的咪唑。微量的咪唑足可以使膠體金聚集、死金、沉淀，而且以包涵體形式表達的蛋白，往往需要高濃度的尿素來溶解，尿素對膠體金的破壞也是非常嚴(yán)重的。
硫酸銨沉淀或DEAE純化：硫酸銨沉淀或DEAE純化的血清含有大量的可競爭性結(jié)合膠體金顆粒表面結(jié)合位點的雜蛋白，產(chǎn)生的強電解質(zhì)和高鹽成分，從而影響檢測分析的結(jié)果并降低檢測分析的靈敏度。
ProteinA/G純化：如果采用A蛋白或G蛋白柱層析純化小鼠腹腔血清抗體作為膠體金結(jié)合物標(biāo)記原料，由于抗體原料中含有大量的非特異性的小鼠本身IgG，導(dǎo)致膠體金結(jié)合物中含有大量非特異性的膠體金結(jié)合物，從而降低檢測分析的靈敏度。而重組抗體則會避免小鼠自身的IgG，且純度較高。
解決方法：如果抗原、抗體存在上述干擾物質(zhì)，建議可以通過超濾或者透析去除。很多人反饋在透析重組抗原/抗體診斷原料的時候，很容易產(chǎn)生大量的沉淀，特別是包涵體抗原。主要原因是透析液不太合適，應(yīng)選擇盡量偏離蛋白等電點的pH緩沖液，如果不確定蛋白的等電點，建議用20mM Tris-HCL(8.5)或者20mM Tris-甘氨酸(8.5)來做透析液，適用于絕大部分的抗原抗體原料。
2. 抗體亞型
單克隆抗體需要特別注意的是，不同的單抗類和亞型對膠體金標(biāo)記的影響。一般來講，IgG1亞型標(biāo)記效果最好，其它亞型和類或多或少存在一定的局限性，但是我們經(jīng)常會篩選到IgG2a、IgG2b這些亞型，甚至偶爾會遇到IgM、IgA，此時，這些最好用于NC膜的包被，絕大部分的亞型和類包被NC膜都沒有問題。如果確實需要用于膠體金標(biāo)記，建議有條件使用（如高標(biāo)記pH，低標(biāo)記量，強封閉）。
3. 蛋白純度
在體外診斷試劑制備過程中，抗體標(biāo)記效率與抗體的純度有關(guān)。當(dāng)抗體純度較低時，會導(dǎo)致抗體與其他雜蛋白被一起標(biāo)記，從而影響了體外診斷試劑的反應(yīng)性能，如特異性、反應(yīng)信號、背景值等?？贵w的純度通常由細胞培養(yǎng)工藝和抗體純化工藝所決定。使用無血清培養(yǎng)基可以很大程度上去除血清培養(yǎng)基中帶來的雜質(zhì)蛋白，而蛋白質(zhì)純化工藝則可以進一步將抗體中絕大多數(shù)雜質(zhì)去除。
4. 保存液
在蛋白的保存過程中，可能會加入一些甘油、蔗糖之類的物質(zhì)作為保護劑，而這些保護劑由于其強親水性，對抗原/抗體診斷原料的膠體金標(biāo)記和包被都會產(chǎn)生不利影響。
比較理想的抗原、抗體保存液：10mM/20mM PB（7.4~8.0）、10mM/20mM PBS（7.4~8.0）、20mM Tris-HCL（8.0~9.0）、20mM Tris-甘氨酸（8.0~9.0）。另外，可加入適量防腐劑，如：0.1%~0.5%疊氮鈉，不推薦使用ProClin300防腐，ProClin300對膠體金標(biāo)記會有一定程度的影響，雖然這種影響并不是很嚴(yán)重，但是有潛在的風(fēng)險。
膠體金檢測常見問題分析
（1）在膠體金檢測平臺，C、T線顏色不一致，檢測結(jié)果如何判斷？
若是消線法，只要C，T線在規(guī)定時間內(nèi)都顯色，不管顏色是否一致，就可判為陰性，T線不顯色則判為陽性。
若是比色法，T線比C線深，判為陰性，T線比C線淺或T線不顯色，則判為陽性。
對于夾心法產(chǎn)品，只要C，T線在規(guī)定時間內(nèi)都顯色，就可判為陽性，T線顯色越深，表示陽性越強。
（2）在使用膠體金檢測卡過程中，能否用水或者其他液體作為陰性樣本對照？
不能。一方面因為檢測樣本成分很復(fù)雜，用水作為陰性對照沒有參考意義。另一方面不同的產(chǎn)品檢測體系不同，用水作對照容易造成假陽或漏檢等現(xiàn)象。
（3）不同廠家的膠體金檢測卡作比較時，能做幾份標(biāo)本就下結(jié)論判斷哪家產(chǎn)品好嗎？
不能。判斷膠體金試紙條主要的指標(biāo)有試劑的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、精密度等指標(biāo)，其中靈敏度和特異性是最關(guān)鍵的。靈敏度的考評就需要由不同樣本做添加，還需要由高濃度的陽性樣本做倍比稀釋。特異性也需要做不同區(qū)域和特殊樣本的檢驗。因為不同廠家的檢測條雖然原理是相同的，但原料來源不相同，做幾份是不能反映檢測條的綜合性能指標(biāo)。
（4）樣品層析速度慢或者不發(fā)生層析
原因分析：
加樣量太少
樣本過于粘稠
試紙條失效
建議處理方案
增加加液量或滴加少量輔助液
滴加少量輔助液，對樣本進行預(yù)處理以去除沉淀物
更換新試紙條重新檢測，試紙條現(xiàn)拆現(xiàn)用
（5）測全血時，有大量的全血樣本析出，NC膜背景偏紅，影響結(jié)果判讀
原因分析：
該試紙條NC膜嚴(yán)重受損或斷裂
使用已溶血的全血標(biāo)本
建議處理方案
更換新試紙條重新檢測
盡量使用新鮮全血檢測
（6）漏檢率偏高
原因分析：
檢測時間太短，判斷結(jié)果過早
加樣量太少，輔助液滴加過量，樣本被稀釋
樣本中被檢物濃度太低
個別樣本中含有較為特殊物質(zhì)，樣本的pH值過高或過低
該試紙條受潮，活性下降或失活
建議處理方案
按說明書要求正確判讀，建議對于較弱性或陰性樣本可延遲
按說明書要求正確加樣或輔助液
采用其他檢測方法進行確認(rèn)
（7）檢測結(jié)果假陽性率高
原因分析：
該試紙條靈敏度偏高
該樣本含有特殊干擾物或已被污染
在規(guī)定時間后判讀結(jié)果
建議處理方案
提前判讀結(jié)果或更換新檢測卡重新檢測
用其他檢測方法確診檢測結(jié)果，確保樣本不受污染
按說明書要求正確判讀結(jié)果，超出判讀結(jié)果的時間范圍，結(jié)果不準(zhǔn)確
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