與競爭法相比小分子免疫檢測夾心法的優(yōu)勢在哪里？
藥物、環(huán)境污染物、化學(xué)污染物等小分子物質(zhì)的檢測是臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析等領(lǐng)域的重要課題。幾十年來，免疫檢測作為一種敏感、直接、經(jīng)濟(jì)的測量分析系統(tǒng)，一直是目標(biāo)分析物可量化測量的支柱。免疫檢測通常分為兩大類，競爭法和非競爭法，非競爭法中最常用的就是夾心法。競爭免疫檢測與夾心免疫檢測，兩者在檢測原理、分析性能上有著本質(zhì)性差異。在競爭免疫檢測中，分析物與標(biāo)記的（或固定的）分析物競爭有限的特異性抗體。相反，夾心免疫檢測可以結(jié)合基于過量存在的兩種不同抗體的分析物，賦予更高水平的靈敏度、精度和特異性。
1.檢測原理差異
競爭免疫檢測原理
在競爭免疫測定中，通常只采用一株抗體，且反應(yīng)體系中抗體數(shù)量相對(duì)于待測物質(zhì)數(shù)量是有限或不足的。示蹤劑通過標(biāo)記目標(biāo)分析物的類似物進(jìn)行制備，示蹤劑與樣本中的待測物共同競爭有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)，被捕獲示蹤劑的數(shù)量與樣本中分析物的濃度成反比關(guān)系。
夾心免疫檢測原理
在夾心免疫測定中，通常采用兩株抗體，可與分析物形成“三明治夾心”結(jié)構(gòu)。其中一株抗體被固定在固相載體上，用于從樣本中捕獲分析物，另一株抗體特異性識(shí)別分析物的另一位點(diǎn)，用于構(gòu)建信號(hào)生成系統(tǒng)，產(chǎn)生檢測信號(hào)。產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與樣本中分析物濃度存在一定的正比關(guān)系。
表1.夾心與競爭免疫檢測的原理差異
| 檢測方法 | 夾心法 | 競爭法 |
| 試劑用量 | 試劑過量 | 試劑限量 |
| 抗體株數(shù) | 識(shí)別位點(diǎn)不同的兩株抗體 | 一株抗體 |
| 信號(hào)強(qiáng)度 | 與分析物濃度成正比 | 與分析物濃度成反比 |
| 信號(hào)響應(yīng) |
|
|
| 檢測結(jié)果 | 反映被分析物占用 的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量 |
反映未被分析物占用 的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量 |
競爭法靈敏度主要取決于抗體的結(jié)合能力（平衡常數(shù)），夾心法靈敏度受平衡常數(shù)的影響較低，靈敏度主要取決于分析物存在時(shí)的信號(hào)增益幅度和分析物不存在時(shí)的測量誤差。從信號(hào)響應(yīng)曲線來看，夾心法與競爭法產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的位置不同，夾心法鉤狀效應(yīng)發(fā)生在抗體高劑量時(shí)，競爭法則發(fā)生在抗體低劑量時(shí)。一般來說，在低背景下測量強(qiáng)信號(hào)要比測量兩個(gè)弱信號(hào)之間的差異容易得多?；谶@個(gè)原因，夾心法理論上具備比競爭法更高的靈敏度。此外，在動(dòng)力學(xué)方面過量使用捕獲和示蹤抗體，有利于抗體-抗原-抗體復(fù)合物的形成，從而提高敏感性。
2.小分子免疫檢測夾心法優(yōu)勢的實(shí)踐研究
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在開展小分子夾心免疫檢測中分析物最小表位距離的研究中，比較了夾心和競爭免疫檢測對(duì)不同表位距離模式分析物的檢出限（LOD）、檢測范圍及特異性。發(fā)現(xiàn)在合適的抗原表位間距下，盡可能避免抗體空間位阻，這時(shí)夾心免疫檢測比競爭免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍，更適合用于小分子的測定。
2.1小分子夾心與競爭免疫檢測的初步比較
2.1.1目標(biāo)分析物
研究團(tuán)隊(duì)首先選擇了兩個(gè)典型的半抗原表位三聚氰胺（MEL）和對(duì)硝基苯胺（NIA），并用不同長度的線性鏈連接子（1-14個(gè)亞甲基）來模擬表位距離，創(chuàng)建了9個(gè)模型分析物，并將其命名為MN1-MN9。此外，為了評(píng)估這兩種免疫分析格式的特異性，在MN3的NIA端添加了一個(gè)甲基，合成了一種新的結(jié)構(gòu)類似物。模型分析物及用于產(chǎn)生檢測抗體的半抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。
圖1.模型分析物和半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)
注：（a）表位距離從2.4到19.0?（a圖下部分）不同的MEL和NIA（a圖上部分）組成的9種模型分析物示意圖。（b）不同間隔臂長度的MEL半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原M1（n=1），半抗原M2（n=3），半抗原M3（n=5），半抗原M4（n=7），半抗原M5（n=9），半抗原M6（n=11）。（c）不同間隔臂長度的NIA半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原N1（n=0），半抗原N2（n=2），半抗原N3（n=4），半抗原N4（n=6），半抗原N5（n=8），半抗原N6（n=10）。
表2.模型分析物分子量和表位距離
| 模型分析物 | 分子量（Da） | 表位距離（?） |
|---|---|---|
| MN1 | 304 | 2.4 |
| MN2 | 318 | 3.8 |
| MN3 | 332 | 4.9 |
| MN4 | 346 | 6.3 |
| MN5 | 374 | 8.8 |
| MN6 | 402 | 11.3 |
| MN7 | 430 | 13.9 |
| MN8 | 458 | 16.4 |
| MN9 | 486 | 19.0 |
2.1.2夾心和競爭免疫檢測的比較
研究團(tuán)隊(duì)選擇了半抗原MEL（M4）的單克隆抗體7A3和半抗原NIA（N4）的單克隆抗體17B3，對(duì)模型分析物MN1-MN9及MN3類似物進(jìn)行夾心和競爭免疫檢測。比較了夾心免疫檢測和競爭免疫檢測的LOD、檢測范圍和特異性。在合適的表位距離下（11.6-19.0?），小分子夾心免疫檢測具有更高的靈敏度和檢測范圍。MN6-MN9夾心免疫檢測的LOD非常低（0.00035-0.9nM），檢測范圍比競爭法（LOD為0.001-38.8nM）更寬。MN3類似物的競爭免疫檢測靈敏度與MN3相當(dāng)，而夾心免疫檢測并不識(shí)別MN3類似物，表明夾心免疫檢測對(duì)目標(biāo)分析物具有高特異性。
圖2.模型分析物夾心和競爭免疫檢測的校準(zhǔn)曲線
注：（a）基于單克隆抗體（mAb）7A3的競爭免疫檢測對(duì)MEL、MN1-MN9和類似物的校準(zhǔn)曲線（n=3）。（b）基于mAb 17B3的競爭免疫檢測對(duì)NIA、MN1-MN9和類似物的校準(zhǔn)曲線（n=3）。（c）以mAb 7A3為捕獲抗體、mAb 17B3為檢測抗體對(duì)MN1-MN9、MEL、NIA和類似物的夾心免疫檢測的校準(zhǔn)曲線（n=3）。
表3.MN模型分析物夾心與競爭免疫檢測的檢測限和線性范圍
| 模型分析物 | 檢測限（nM） | 檢測范圍（nM） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 7A3+17B3 | 7A3 | 17B3 | 7A3+17B3 | 7A3 | 17B3 | |
| MN1 | 29944 | 0.2 | 0.6 | 57425-532076 | 10.3-304.2 | 2.1-133.3 |
| MN2 | 21402 | 0.5 | 0.5 | 41759-410439 | 2.7-174.2 | 1.2-106.9 |
| MN3 | 19202 | 0.9 | 0.17 | 38546-392930 | 1.9-21.8 | 5.3-270.5 |
| MN4 | 15335 | 0.7 | 0.02 | 34444-547784 | 1.5-16.5 | 0.07-3.5 |
| MN5 | 265.4 | 0.08 | 0.03 | 504.1-4516.8 | 0.3-14.6 | 0.09-3.1 |
| MN6 | 0.002 | 0.004 | 0.6 | 0.019-123.5 | 0.02-10.1 | 1.8-84.3 |
| MN7 | 0.00035 | 0.001 | 0.7 | 0.0034-220.3 | 0.004-0.33 | 1.5-428.0 |
| MN8 | 0.0094 | 0.4 | 1.7 | 0.078-106.7 | 1.9-47.8 | 5.0-4686 |
| MN9 | 0.9 | 38.8 | 33.7 | 16.2-35399 | 134-9535 | 98.1-3805 |
| 類似物 | / | 0.6 | 0.3 | / | 1.3-16.9 | 1.8-896.1 |
注：夾心和競爭免疫檢測的檢出限（LOD）定義為使ODmax（IC10）降低10%的分析物濃度。在IC20和IC80之間建立檢測范圍。/代表陰性結(jié)果。
2.2小分子夾心免疫檢測優(yōu)勢的進(jìn)一步驗(yàn)證
為了驗(yàn)證“合適的抗原表位間距下，夾心免疫檢測比競爭免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍?！边@一結(jié)論。研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一組新的模型分析物，進(jìn)一步比較了夾心免疫檢測和競爭免疫檢測的LOD、檢測范圍和特異性，結(jié)果與初步研究結(jié)果一致。
2.2.1目標(biāo)分析物
使用廣泛用于人類和獸醫(yī)診所的典型抗菌劑磺胺芐胺（SBA）和諾氟沙星（NOR），合成了兩種新的模型分析物SBA-C2-NOR和SBA-C10-NOR。
表4.模型分析物分子量和表位距離
| 模型分析物 | 分子量（Da） | 表位距離（?） |
|---|---|---|
| SBA?C2?NOR | 679 | 3.8 |
| SBA?C10?NOR | 791 | 13.9 |
2.2.2夾心免疫檢測的優(yōu)勢驗(yàn)證
用半抗原SBA的單克隆抗體4D11和半抗原NOR的單克隆抗體N2H3A8，對(duì)模型分析物SBA?C2?NOR和SBA-C10-NOR進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，與競爭免疫檢測相比，夾心免疫檢測對(duì)SBA-C10-NOR（抗原表位距離為13.9?）的敏感性、檢測范圍和特異性方面，具有明顯的優(yōu)勢，其中LOD較競爭法提高了近30倍。
圖3.模型分析物夾心和競爭免疫檢測的校準(zhǔn)曲線
表5.模型分析物夾心與競爭免疫檢測的檢測限和線性范圍
| 模型分析物 | 檢測限（nM） | 檢測范圍（nM） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 4D11+N2H3A8a | 4D11b | N2H3A8c | 4D11+N2H3A8a | 4D11b | N2H3A8c | |
| SBA?C2?NOR | 0.3 | 0.53 | 0.13 | 0.89-37.43 | 1.18-18.64 | 0.30-4.80 |
| SBA?C10?NOR | 0.02 | 0.61 | 0.21 | 0.33-48.22 | 1.38-22.58 | 0.47-7.30 |
a.基于4D11和N2H3A8抗體的夾心免疫檢測結(jié)果。
b.基于4D11抗體的競爭免疫檢測結(jié)果。
c.基于N2H3A8抗體的競爭免疫檢測結(jié)果。
夾心免疫檢測在小分子檢測中的主導(dǎo)作用，很大程度上取決于目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)和最佳抗體對(duì)。兩個(gè)抗體識(shí)別分析物的表位距離適當(dāng)時(shí)，會(huì)避免抗體空間位阻，此時(shí)夾心法比競爭法免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍，更適合用于小分子測定。
參考文獻(xiàn)
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