RT-qPCR檢測原理

逆轉錄實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）將逆轉錄反應（RT）與實時熒光聚合酶鏈式反應（qPCR）相結合，是當下病原學分子診斷的常用方法。RT-qPCR以RNA為起始材料，在RT階段，運用逆轉錄酶以RNA為模板形成互補的DNA鏈（cDNA）。隨后以cDNA為模板進行qPCR反應。RT-qPCR已被用于多種分子生物學的應用中，其中包括病原體檢測、基因測試、疾病研究和基因表達分析。

1.RT-qPCR的一步法與兩步法

1）一步法：將逆轉錄與PCR擴增結合在一起，使逆轉錄酶與DNA聚合酶在同一管內同樣緩沖液條件下完成反應。由于兩步反應都在一個管中完成，因此該方法具有更少的實驗誤差和移液步驟，減少污染的風險。

2）兩步法：將逆轉錄和PCR擴增過程分開，在兩個管中完成檢測。需要使用不同的緩沖液、反應條件、以及引物設計策略。由于反應分步進行，能夠優(yōu)化單一反應過程的反應緩沖液和反應條件，可建立長期保存，并用于多次反應的穩(wěn)定cDNA庫。

2.RT階段

RNA是逆轉錄的模板。根據(jù)來源材料的類型和實驗目標，有多種方法可進行RNA的提取。較常用的有Trizol法、離心柱法和磁珠法。在RT階段，引物在退火時與單鏈RNA結合，提供給逆轉錄酶一個用于合成的起點位置。逆轉錄酶利用RNA合成cDNA，得到穩(wěn)定的RNA-DNA雜交鏈。

引物可分為三種引物Oligo引物（dT）、隨機引物和序列特異性引物。Oligo引物（dT）包含錨定位點，確保引物結合至mRNA 3'端poly(A）尾部。隨機引物長度6-9個堿基，在RNA轉錄過程中，可退火至多個位點，提高cDNA產量。序列特異性引物是靶向特異的RNA序列的定制引物，可產出特異的cDNA庫。通常情況下將Oligo引物與隨機引物混合使用為逆轉錄酶提供結合位點。當檢測RNA病毒時需要使用序列特異性引物，結合在靶標序列上。

逆轉錄酶需要具有較高熱穩(wěn)定性和較低核糖核酸酶H（RNase H）活性。較高熱穩(wěn)定性可以保證逆轉錄酶在整個反應中的活性來獲得更高的 cDNA 產量，減少非特異性擴增。較低的RNase H活性可以減少RNA的降解來避免截短cDNA。

3.qPCR階段

1）染料法：加入一對引物和SYBR GreenⅠ熒光染料。退火階段，引物特異性結合在兩條鏈上，為DNA聚合酶提供結合位點。SYBR GreenⅠ熒光染料是一種DNA雙鏈小溝結合染料，DNA聚合酶延伸引物，形成雙鏈，染料結合于雙鏈小溝中發(fā)出熒光。反應體系內雙鏈DNA濃度越高熒光信號越強。由于染料法無法在同一個反應中檢測多個目的片段，還會受到引物二聚體的影響。在這種情況下，需要進行熔解曲線分析，判斷擴增所得產物是否只有一種。

圖1. 染料法發(fā)光原理

2）探針法：將熒光染料替換為一條Taq Man探針。探針具有與靶標互補的序列，5'端標記一個熒光報告基團，3'端標記一個熒光淬滅基團，當探針完整時，熒光信號會被淬滅基團吸收。退火階段，探針特異性結合到靶標序列上，DNA聚合酶沿5'-3'方向合成新鏈直至探針 5'端時，聚合酶水解探針，使熒光報告基團與淬滅基團分離，產生熒光。3'端淬滅基團阻止探針被DNA聚合酶擴增。Taq Man探針結合的目標越多，熒光信號越強。理論上，探針法中的熒光只來源于靶標，也就是不受非特異性擴增和引物二聚體影響。

圖2. 探針法發(fā)光原理

4.結果分析

1）熔解曲線：當擴增完成后，對反應體系進行升溫檢測，同時監(jiān)測熒光信號。當?shù)竭_某一溫度后，雙鏈DNA迅速解鏈，熒光信號驟降。當信號達到最低時，即可獲得熒光信號強度隨溫度變化的原始圖譜。對原始圖譜進行負導數(shù)轉換，繪制熒光信號變化與溫度的關系圖，圖中峰值對應的溫度即為Tm值?；赥m值的差異，便可區(qū)分產物。

熔解曲線一般用于染料法，出現(xiàn)單峰說明擴增產物特異性好；出現(xiàn)雜峰特異性差，存在非特異性擴增。若熔解曲線只有單峰且對應溫度是退火溫度則是靶標發(fā)出的熒光，實驗結果有效。

圖3. 染料法熔解曲線

2）擴增曲線：將已知濃度的靶標稀釋幾個數(shù)量級后進行qPCR反應循環(huán)擴增，并用產生的熒光信號與相應濃度生成標準曲線。將未知樣本的Ct值與該標準曲線進行比對，可以確定其濃度。

熒光閾值是PCR 3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍（熒光閾值要設定在PCR擴增的指數(shù)期）。qPCR的擴增曲線與熒光閾值交點對應的橫坐標就是循環(huán)數(shù)（Ct）值。Ct值越低證明樣本中靶標越多。從qPCR的曲線中可以看出，在基線期，沒有明顯的熒光信號。隨著循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號逐漸增強。在平臺期，因酶活降低或dNTP被消耗殆盡，曲線趨于平緩。

圖4. qPCR擴增曲線

參考文獻

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