化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）發(fā)光原理
化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與高特異性的酶免疫分析技術(shù)相結(jié)合，用于檢測微量物質(zhì)的免疫檢測技術(shù)。CLEIA反應(yīng)基本原理是用參與催化某一發(fā)光反應(yīng)的酶來標(biāo)記抗體（或抗原），在抗原-抗體反應(yīng)后加入化學(xué)發(fā)光底物，酶催化和分解底物發(fā)光，用光檢測儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)光強(qiáng)換算出被測物的濃度。CLEIA常用方法包括：用于大分子抗原檢測的雙抗體夾心法、用于抗體檢測的雙抗原夾心法，和用于多肽類小分子抗原測定的競爭法。根據(jù)標(biāo)記酶和酶促化學(xué)發(fā)光底物的不同CLEIA又可以分成不同的反應(yīng)體系，其中辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）作為標(biāo)記酶的CLEIA反應(yīng)體系是最為常見的。
ALP標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）是一種分子量為80kD或100kD的磷酸單酯水解酶，可從大腸桿菌或小牛腸黏膜提取獲得。ALP最適pH為9.6（腸黏膜）或8.0（菌源性），在堿性環(huán)境中能夠?qū)⒌孜锶チ姿峄?。堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物有AMPPD（1，2－二氧環(huán)乙烷衍生物，螺旋金剛烷）、CDP Star、APS-5等，其中AMPPD是最常見的ALP酶促化學(xué)發(fā)光底物。
1）ALP-AMPPD發(fā)光體系
AMPPD中文全稱為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷，是一種生物化學(xué)領(lǐng)域中超靈敏的堿性磷酸酶底物，具有底物穩(wěn)定性好、反應(yīng)速度快的特點(diǎn)。AMPPD分子結(jié)構(gòu)中有兩個重要部分，一個是連接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節(jié)環(huán)，它可以斷裂并發(fā)射光子；另一個是磷酸根基團(tuán)，它維持著整個分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。堿性條件下AMPPD在ALP的作用下脫去磷酸根基團(tuán)，形成一個不穩(wěn)定的中間體AMPD。AMPD分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移后裂解成金剛烷酮和處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，釋放出光子回到基態(tài)，產(chǎn)生470nm的光，持續(xù)時間可達(dá)幾十分鐘至數(shù)小時。
2）ALP-CDP Star發(fā)光體系
CDP-Star中文名為2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-（5-氯三環(huán)[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基] -1-苯基磷酸二鈉，是由AMPPD改進(jìn)而來，對ALP標(biāo)記分子的檢測更靈敏，反應(yīng)動力學(xué)更好。CDP-Star具有低背景、酶催化強(qiáng)度高、光輸出時間長的特點(diǎn)。
3）ALP-APS-5發(fā)光體系
APS-5中文名為9-（4'-氯苯硫代磷酰氧亞甲基）-10-甲基-9，10-二氫化吖啶二鈉鹽，是一種基于9，10-二氫吖啶的發(fā)光底物，在ALP作用下可以持續(xù)發(fā)光。APS-5對ALP標(biāo)記分子的檢測靈敏，但未在ALP標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析上廣泛應(yīng)用。
HRP標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）來源于蔬菜植物辣根中，分子量為40kD，由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結(jié)合而成。輔基是酶活性基團(tuán)，最大吸收峰在403nm處；而主酶與酶活性無關(guān)，最大吸收峰在275nm。HRP常用的化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）、異魯米諾（4-氨基苯二甲酰肼）及其衍生物。用于辣根過氧化物酶（HRP）的化學(xué)發(fā)光底物多為雙組分系統(tǒng)，穩(wěn)定的H2O2和魯米諾（5－氨基－鄰苯二甲酰肼）是經(jīng)典的HRP標(biāo)記CLEIA反應(yīng)體系。
1）HRP-H2O2-魯米諾發(fā)光體系
魯米諾（Luminol）又名發(fā)光氨，是一種化學(xué)熒光分子。堿性條件下，HRP催化魯米諾和過氧化氫的氧化反應(yīng)，魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時生成了一個雙負(fù)離子（Dianion），它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個有機(jī)過氧化物。該過氧化物立即分解出氮?dú)猓斆字Z被有機(jī)氧化劑如二甲基亞砜氧化后不是生成氮?dú)?，而是生成含氮有機(jī)物），生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍(lán)光部分，可在425nm下進(jìn)行檢測。
2）HRP-H2O2-魯米諾-增強(qiáng)劑發(fā)光體系
傳統(tǒng)的HRP-H2O2-魯米諾CLEIA反應(yīng)體系發(fā)光量低、不易測量，在發(fā)光體系中加入增強(qiáng)劑，魯米諾的發(fā)光靈敏度和發(fā)光信號提高，同時發(fā)光穩(wěn)定時間延長，降低氧化劑與發(fā)光劑等單獨(dú)作用時出現(xiàn)的“本底”發(fā)光。常用的增強(qiáng)劑有苯酚類、芳香胺類及苯基硼酸衍生物等，其中苯基硼酸類增強(qiáng)劑可以和苯酚類增強(qiáng)劑同時加入以提高分析靈敏度。
增強(qiáng)劑增強(qiáng)原理
當(dāng)?shù)攘康腍2O2與HRP混合后，有活性的酶底物復(fù)合物（Complex Ⅰ）迅速形成，但Complex Ⅰ與供氫體結(jié)合形成的復(fù)合物（Complex Ⅱ）形成速度較慢，而酚類及其芳香胺類等化合物都可作為HRP的第二底物（即供氫體），使得在反應(yīng)中Complex Ⅰ及Complex Ⅱ的靜態(tài)濃度增大，顯著加快酶的循環(huán)速度。在增強(qiáng)劑的作用下，HRP-H2O2-魯米諾體系中的信號都被不同程度的增強(qiáng)，一定程度上解決了發(fā)光體系量子效率低、反應(yīng)發(fā)光時效短等缺點(diǎn)，使HRP的靈敏度及精密度大大提高。
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