新冠中和抗體原理及檢測
談“毒”色變是人類對于病毒一直以來的態(tài)度，從埃博拉到SARS，再到如今的2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），無不對人類健康產(chǎn)生了巨大威脅。了解病毒的入侵機(jī)制對于研究相應(yīng)治療方案必不可少。SARS-CoV-2病毒中有個重要的棘突S蛋白（spike protein），S蛋白是一類由S1/S2異二聚體組成的三聚體跨膜糖蛋白，可識別宿主細(xì)胞受體-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）并介導(dǎo)膜融合，其含有的一個C端受體結(jié)合域（RBD）更是直接參與了宿主受體的識別，介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。
中和抗體
免疫系統(tǒng)在經(jīng)受病毒刺激后會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，有些抗體可以和病毒顆粒結(jié)合，阻止病毒感染細(xì)胞，以此把病毒“中和”掉了，這些抗體就稱為“中和抗體”。也就是說，中和抗體實際上是普通抗體的一種。我們正常所說的抗體是指病毒入侵后機(jī)體產(chǎn)生的抗體的統(tǒng)稱，它包含針對不同病毒識別表位產(chǎn)生的多個抗體，大部分抗體是通過向T-淋巴細(xì)胞發(fā)出鎖定抗原的信號，激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，殺死病毒，而中和抗體則是特異針對病毒中和表位產(chǎn)生的抗體，可直接靶定到病毒中和表位，使病毒失去結(jié)合受體的能力，這一過程不需要激活T-淋巴系統(tǒng)。同時研究發(fā)現(xiàn)不同結(jié)合表位的中和抗體活性也存在差異，其中與病毒中和表位完全吻合的中和抗體活性最好，與病毒中和表位有差異但存在一定覆蓋的中和抗體活性顯著降低。
在新冠疫情大肆蔓延的背景下，國家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布了《新型冠狀病毒中和抗體產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)急項目申報指南》，申報指南指出中和抗體具備阻斷病毒侵染目的細(xì)胞的潛力，且單克隆抗體具有作用機(jī)制明確、易于大規(guī)模產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，是新冠病毒治療藥物研究的重點(diǎn)方向。科學(xué)家們紛紛將目光投向了新型療法---中和抗體療法。近期由清華大學(xué)和深圳國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心合作，成功從新冠感染者外周血單核細(xì)胞中分離出了表達(dá)抗體的B細(xì)胞，并在人體外實現(xiàn)了抗體表達(dá)，獲得了2株中和功能較好的單克隆抗體。這種單克隆抗體抗體便是能特異性結(jié)合RBD蛋白，并有效阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體ACE2蛋白結(jié)合的新冠中和抗體。
2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）中和抗體的檢測方法
新冠中和抗體的檢測可以反映群體的感染率、個人的康復(fù)情況以及疫苗的效果，但傳統(tǒng)的病毒中和實驗需使用活病毒和細(xì)胞，且對實驗室安全性及操作人員技能要求較高。這種耗時長、要求高的傳統(tǒng)中和檢測方法顯示不適用于傳播速度快、感染覆蓋范圍廣的新冠疫情。因此，衍生出了幾種無需使用感染性病毒、快速檢測新冠中和抗體的方法。
一、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測
該方法利用新冠病毒蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域RBD抗原和受體蛋白ACE2抗原之間的結(jié)合，模擬病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，通過顯色反映判斷病毒感染情況，但當(dāng)中和抗體存在時，便會阻斷蛋白互作，顯色反應(yīng)減弱。
二、膠體金試紙條
膠體金平臺利用競爭法檢測中和抗體，RBD抗原用膠體金標(biāo)記并固定在結(jié)合墊上，ACE2抗原固定在NC膜的T線上，能與膠體金標(biāo)記RBD抗原特異結(jié)合的抗體固定于NC膜的C線上。當(dāng)待測樣品中有新冠中和抗體時，中和抗體會和RBD抗原結(jié)合，降低了RBD和ACE2的結(jié)合效率，T線顯色度顯著下降。
三、hiVNT系統(tǒng)
“hiVNT系統(tǒng)”依賴于一個人為改造的生物發(fā)光報告基因NanoLuc熒光素酶，NanoLuc可切分成兩個亞基，分別是11aa的小亞基HiBiT和156aa的大亞基LgBiT，兩個亞基分開時不具有發(fā)光活性，但是融合后又能恢復(fù)熒光素酶的活性。 “hiVNT系統(tǒng)”檢測新冠中和抗體就是通過組合表達(dá)S蛋白和帶HiBiT標(biāo)簽的病毒樣顆粒VLP，當(dāng)S蛋白與VeroE6/TMPRSS2細(xì)胞表面ACE2受體結(jié)合后，VLP膜與宿主細(xì)胞膜融合，衣殼蛋白被吸收到細(xì)胞中后，HiBiT與宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的LgBiT蛋白相互作用形成NanoLuc熒光素酶，如果同時添加含中和抗體的血清（如新冠康復(fù)期患者的血清），NanoLuc熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度顯著下降，該檢測方法可以作為評價新冠治療效果的依據(jù)。
目前這幾種新冠中和抗體檢測方法都兼具快速、高通量的特征，可針對性地檢測干預(yù)治療后新冠患者體內(nèi)的中和抗體數(shù)量，作為疫苗有效性的檢測標(biāo)準(zhǔn)，為后期新冠疫苗大規(guī)模篩選提供最合適、最快速的檢測方法學(xué)。
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