糖化血紅蛋白（HbA1c）的檢測方法

全球糖尿?。―M）患病率很高，是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，DM的防治一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的DM診斷和治療檢測采用空腹血糖（FBG）、餐后血糖（OBG）和口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時(shí)的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（GHb）作為反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)，也是檢測DM治療的重要指標(biāo)。1985年Allen等報(bào)告用陽離子交換層析儀把人類HbA分離成至少3種比HbA帶更多陰電荷的較小成分，按照從柱中洗滌出來的順序先后把它們分別稱為HbA1a、HbA1b和HbA1c。但當(dāng)時(shí)并沒有發(fā)現(xiàn)這些成分與DM之間的關(guān)系。直到1975年，人們才逐漸認(rèn)識到HbA1c來源于葡萄糖結(jié)合經(jīng)翻譯修飾后的HbA，以及HbA1c與FBG、葡萄糖耐量試驗(yàn)中的葡萄糖峰值以及曲線下面積、過去數(shù)周的平均血糖水平等之間的密切關(guān)系。

臨床實(shí)驗(yàn)室常用的HbA1c分析方法分為兩大類：一類基于HbA1c和非HbA1c所帶的電荷不同，包括陽離子交換層析法。電泳法和等電位聚焦法；另一類基于GHb基團(tuán)結(jié)構(gòu)不同，包括親和層析法和免疫學(xué)方法。

1. 乳膠凝集反應(yīng)法

乳膠凝集反應(yīng)法是利用糖化血紅蛋白（HbA1c）抗原與HbA1c抗體直接測定總血紅蛋白Hb中的糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量。目前國內(nèi)外幾家廠商可以提供HbA1c測定的試劑盒。這種免疫反應(yīng)是由被測血樣品種的總Hb和HbA1c與試劑中的HbA1c抗體結(jié)合而形成凝集，凝集量隨HbA1c蛋白濃度的大小而變化。用生物分析儀器來進(jìn)行比濁測定HbA1c抗原的濃度，采用終點(diǎn)法，生化儀通過測定反應(yīng)液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出HbA1c占Hb的百分含量，測定時(shí)，儀器多采用660nm單色光做主波長，800nm單色光做副波長，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實(shí)測值。由于這種試驗(yàn)其標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的，所以在測定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5種不同濃度的定標(biāo)液，做出5點(diǎn)非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線和數(shù)值存在生化儀的貯存器中，測定樣品時(shí)，實(shí)測出的吸光度值A(chǔ)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，由儀器CPU求出實(shí)測樣品中的HbA1c百分含量。乳膠凝集反應(yīng)法測定HbA1c方便、不用增加儀器，可直接用自動生化分析對樣品進(jìn)行快速測定。該方法也可以用手工的方法，在酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，是目前使用較多的方法。但乳膠凝集反應(yīng)法其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺。

2. 離子交換高壓液相色譜法HPLC

使用離子交換高壓液相色譜HPLC（high pressure liquid chromatography）來測定糖化血紅蛋白（HbA1c）的百分含量目前被認(rèn)為是分析HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)。采用HPLC方法工作的全自動糖化血紅蛋白分析儀器，儀器快速、簡便、精巧、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，受到越來越多用戶的歡迎。

色譜分析是一類利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質(zhì)相對運(yùn)動過程中，將混合物中的各種成分分離開的一種分析技術(shù)。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液相的色譜法的總稱。色譜法又叫色層或?qū)游?，這一技術(shù)在生命科學(xué)研究中用于生物活性物質(zhì)的分析；生物活性物質(zhì)是以混合物形式存在，人類血液中的蛋白質(zhì)有上千種，只有把混在一起的被測蛋白分離出來，才能準(zhǔn)確測定；在HbA1c的測定時(shí)，可以通過高精度HPLC，將HbA1c從Hb中分離出來，才能得到準(zhǔn)確的數(shù)值。在生命科學(xué)研究中，活性物質(zhì)的分離主要應(yīng)用的是液相色譜。

3. 糖化血紅蛋白自動分析儀

糖化血紅蛋白自動分析儀采用離子交換HPLC法測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。離子交換HPLC法，是利用能交換離子的材料為固定相來分離離子型化合物的方法。儀器使用陽離子交換柱進(jìn)行HbA1c的百分比測定；當(dāng)一定量的全血樣品被取樣針吸入到進(jìn)樣裝置內(nèi)，在稀釋部分被溶血釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白Hb，并由稀釋液稀釋，稀釋好的已經(jīng)溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。柱內(nèi)的固定相是最新研發(fā)的非多孔性、不溶和可滲透的交聯(lián)高聚物，上面分布固定的帶電荷基團(tuán)和能游走的配衡離子；樣品通過過濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液（流動相）洗脫，使樣品向下移動。此時(shí)溶液中所含血紅蛋白Hb的各種組分即與固定相上能移動的離子進(jìn)行交換，樣品中的血紅蛋白多種組分在固定相上連續(xù)進(jìn)行可逆的交換吸附和解吸作用，而3種不同離子濃度的鹽液，形成線性梯度洗脫。全自動血紅蛋白分析儀能在1分多鐘內(nèi)，將Hb中的多種成分分離，其中HbA1c、HbF、HbA1被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb成分到達(dá)儀器的檢測器，檢測器內(nèi)裝有發(fā)射單色光的發(fā)光二極管，通過雙波長可見光比色法測定HbA1c、HbF、HbA1三個(gè)參數(shù)。儀器的檢測器檢測出分離后HbA1c、HbF、HbA1組分的吸光度值，與HbA1c標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較，分析計(jì)算出結(jié)果，最后以百分率表示的Hb組分結(jié)果與色譜圖一起打印出來。

離子交換柱HPLC法對全血直接測定HbA1c，其批內(nèi)和批間變異系數(shù)CV均可以小于1%，結(jié)果精確，HbA1c檢測結(jié)果不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響，特別適合糖尿病人的監(jiān)控。

4. 金標(biāo)免疫滲濾法(金標(biāo)法) 免疫滲濾法

操作較簡便, 目前代表儀器有挪威NycoCardReaderII特種蛋白多功能全定量金標(biāo)檢測儀。

5. 化學(xué)發(fā)光法

采用離子捕捉免疫分析法, 應(yīng)用HbA1c抗原與HbA1c抗體反應(yīng)原理, 聯(lián)以熒光標(biāo)記物, 通過連接帶負(fù)電的多陰離子復(fù)合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經(jīng)過一系列徹底清洗等步驟后, 測定熒光強(qiáng)度變化率, 計(jì)算濃度。采用專用試劑包和免疫發(fā)光分析儀,其檢測系統(tǒng)易于規(guī)范和重復(fù), 可減少操作技術(shù)誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內(nèi)、批間變異系數(shù)小, 回收率高, 準(zhǔn)確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。

6. 放射免疫法

優(yōu)點(diǎn): 精密度高、特異性強(qiáng)、快速、價(jià)格相對便宜, 可批量測試, 且不受各種干擾因素的影響。缺點(diǎn): 目前對制備高效價(jià)的抗體尚存在許多困難, 仍處于研究中, 未能形成商品化試劑盒。

HbA1c的特點(diǎn)

與血糖值相平行

血糖越高，糖化血紅蛋白就越高，所以能反映出血糖的控制水平。

生成緩慢

血糖是不斷波動的，容易受到進(jìn)食和糖代謝等相關(guān)因素的影響，每次抽血檢測結(jié)果只能反映當(dāng)時(shí)血糖的水平。由于糖化血紅蛋白是逐漸生成的，短暫的血糖升高（降低）不會引起糖化血紅蛋白的升高（降低），并且不受是否空腹、抽血時(shí)間、是否使用胰島素等因素影響，所以更能可靠地反映體內(nèi)血糖水平。